Polybrene (10 mg/mL)
Catalog Number：LE110
01/產品概述
Polybrene（聚凝胺，hexadimethrine bromide）是一種多聚陽離子聚合物，廣泛用于逆轉錄病毒及慢病毒介導的基因轉染，是一種常用的促感染試劑，能夠顯著提高病毒與細胞的接觸及感染效率，其作用機理可能是通過中和細胞表面唾液酸與病毒顆粒之間的靜電排斥從而促進吸附作用。同時，Polybrene也常用于哺乳動物細胞的DNA轉染實驗以增強脂質體的轉染效率。Polybrene也是一種有名的抗肝素劑（肝素拮抗劑），常用來生產非特異性凝集的紅細胞。它還參與到低分子量DNA的轉化中。此外，Polybrene也多用于蛋白測序，因為小劑量的Polybrene在自動測序分析可明顯改善多肽的降解現象。PVDF膜加入polybrene還能提高膜的親和性。
本產品以溶液形式提供，粉末用 0.9% NaCl 配制成10 mg/mL的溶液，并用0.22 μm濾膜過濾除菌。使用時一般按1:1000-1:5000稀釋，依細胞種類不同稀釋比例不同，具體使用濃度請查閱相關文獻。
02/產品組分
03/保存條件
冰袋（wet ice）運輸。-20℃ 保存，有效期24個月。建議分裝保存，避免反復凍融。
04/產品特點
v 即用型試劑，無需進行試劑配置，簡單方便。
v 無菌制劑，可直接加入細胞使用。
05/實驗步驟
慢病毒感染（Lentiviral Infection）實驗步驟如下：
1. 包裝慢病毒并測定慢病毒滴度，通過病毒滴度和MOI計算目的細胞感染所需的病毒量。
2. 實驗前一天，將生長狀態(tài)良好的目的細胞消化計數后稀釋至1-3×105/mL，加入12孔板，1 mL/孔。放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
? 懸浮細胞不需要提前一天接種，實驗前將細胞計數接種后，直接加入病毒混合液即可。
3. 配制慢病毒+polybrene+培養(yǎng)基混合液。polybrene一般使用濃度為2-10 μg/mL，但對某些細胞（如末端分化的神經元，DC細胞等）毒性較大，初次使用建議先做毒性測試。
4. 吸去12孔板中目的細胞的培養(yǎng)基，加入3中配制的慢病毒混合液，放入37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
? 感染懸浮細胞或半懸浮細胞，則需采用平角離心轉染法，即將適量的病毒液加入細胞培養(yǎng)板后，封好口，放入平角離心機中，低速（200xg）離心?1 h?，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
? 若實驗條件有限，沒有平角離心機，可用離心管代替，將細胞吸入離心管中，進行低速離心，去掉大部分上清，加入適量的病毒液，室溫放置?15 min，然后將細胞和病毒液同時吸出轉入培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。
5. 病毒感染16 h后更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
6. 病毒感染36-48 h后，可加入篩選培養(yǎng)基進行穩(wěn)定細胞株篩選，或采用熒光顯微鏡、流式細胞術、western blot、qPCR等方法檢測目的基因表達情況。
06/適用范圍
Polybrene目前廣泛用于逆轉錄病毒及慢病毒介導的基因轉染，是一種常用的促感染試劑，能夠顯著提高病毒與細胞的接觸及感染效率。
07/注意事項
1. Polybrene對某些細胞（如末端分化的神經元、DC 細胞）毒性較大，初次應用建議先做毒性測試。
2. 本說明書中提供的Polybrene使用濃度范圍僅供參考，具體使用濃度請參考相關文獻。
3. 為了您的健康安全，請規(guī)范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗。
4. 所有慢病毒操作均需在BSL2級生物安全柜中進行。
5. 本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。
08/實驗案例分析
1. 提前一天使用10 cm細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001），待細胞密度為75% 左右開始包裝慢病毒。
2. 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進行慢病毒包裝。取10 μL慢病毒包裝輔助質粒混合物（Package Plasmid Mix）加入到2 mL離心管中，加入2.5 μL表達GFP 的對照質粒（Control Plasmid），輕輕混合，加入32 μL PolyShooter轉染試劑與質粒混合，室溫孵育3分鐘。
3. 往上述混合物中加入1.8 mL無血清無雙抗的DMEM基礎培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉染試劑-核酸復合物。
4. 將上述1.8 mL轉染試劑-核酸復合物輕輕地逐滴均勻加入10 cm皿慢病毒包裝細胞中，輕輕搖動培養(yǎng)皿混勻，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)產毒。
5. 轉染24 h后，棄去初始病毒上清液，加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
6. 轉染48 h后，收集病毒上清液，再加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
7. 轉染72 h后，進行二次病毒上清液收集，與48 h收集的上清液混合后，300xg離心10分鐘以除去細胞碎片，0.22 μm濾器過濾，使用ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒濃縮試劑盒（LC110R）進行20倍濃縮，使用1 mL ViralStars LS Lentivirus Storage Solution（LS110R）重懸慢病毒顆粒。
8. 使用上述制備的慢病毒感染目的細胞HEK293T，設置兩組實驗組: (1) 病毒+polybrene (10 μg/mL)+培養(yǎng)基混合液，(2) 病毒+培養(yǎng)基混合液(不添加polybrene)。
9. 使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況，并拍照記錄。使用流式細胞術統(tǒng)計GFP陽性細胞數，實驗結果如圖2所示。
圖2: 慢病毒(GFP)感染目的細胞HEK293T的過程中是否添加polybrene (10 μg/mL)的感染效率對比實驗。
09/其他相關產品
